O ginecologista e obstetra William Masters contratou-a para a Universidade Washington em Saint Louis em 1957, quando ela tinha 30 anos, para poder desenvolver os seus estudos de larga escala sobre a sexualidade humana. Mais tarde, acabariam por formar um casal (em 1972 casaram-se), e divorciar-se (em 1993), embora continuassem a trabalhar em conjunto.
O estudo da sexualidade humana não estava muito desenvolvido em meados do século XX – a excepção era o trabalho de Alfred Kinsey, na Universidade de Indiana, também nos EUA, que tinha publicado dois livros com a sua investigação sobre a sexualidade masculina e feminina, em 1948 e 1953 – mas os planos de Masters eram ambiciosos. Queria fazer “a maior experiência sexual da história dos Estados Unidos”, relata a Associated Press. A Virginia Johnson cabia o trabalho de analisar os estudos de caso, e fazer as perguntas desconfortáveis.

Entre 1957 e 1965, Masters e Johnson mediram a excitação sexual em seres humanos, em 382 mulheres e 312 homens, em observação directa e com métodos de medição que eles próprios desenvolveram.
Fizeram uma série de descobertas em termos fisiológicos e anatómicos: descreveram os mecanismos da lubrificação vaginal e do orgasmo, afastando a ideia de que o orgasmo vaginal (durante uma relação sexual) seria diferente do clítorico (durante a masturbação).

Descobriram também que as mulheres podem ter vários orgasmos, pois não têm, como os homens, um período em que não conseguem ejacular. Foram também os primeiros investigadores a descrever o fenómeno das contracções rítmicas do orgasmo em ambos sexos, medindo a velocidade e a intensidade com que se repetem.
Uma herança duradoura da investigação de Masters e Johnson na ciência da sexualidade humana foi a determinação de que os seres humanos sentem os orgasmos de forma semelhante e que a excitação sexual pode ser descrita em quatro fases distintas: fase de excitação, de plateau, orgásmica e de resolução.
Masters e Johnson publicaram a sua investigação em livros que se tornaram clássicos: Human Sexual Response e Human Sexual Inadequacy, publicados em 1966 e 1970.
Foram best-sellers, menos polémicos que o trabalho de Kinsey, mas mesmo assim denunciados por “porem a tónica na mecânica sexual e não no compromisso amoroso com um parceiro e por não condenarem a actividade homossexual”, recordou o New York Times em 2001, quando morreu William Masters.
Surgiram também algumas críticas ao trabalho, por exemplo a que de algumas das mulheres que participaram nos estudos eram prostitutas, pelo que as suas atitudes face ao sexo seriam diferentes das de outras mulheres.
Também polémico foi o programa que o Instituto Masters e Johnson teve entre 1968 e 1977 para converter homossexuais ou curar a homossexualidade. Esse programa reportou uma taxa de sucesso de 71,6% durante um período de seis meses. Mas em 2009, numa biografia sobre o casal de cientistas intitulada Masters of Sex e num artigo na revista Scientific American, o seu autor Thomas Maier sugeriu que “Virginia Johnson tinha grandes reservas sobre este programa e suspeitava de que estes resultados teriam sido manipulados por William Masters”.
Este livro, Masters of Sex, está a ser transformado numa série de televisão do canal de cabo norte-americano Showtime, com data de estreia prevista para 29 de Setembro.